加速难表达蛋白生产技术的进步，寻找传统抗生素的可行替代品

前言

大肠杆菌素(coliins)是由大肠杆菌产生的抗菌蛋白质。它通过物理损坏发挥细胞杀伤活性，这与大多数常规抗生素不同，大多数常规抗生素通过抑制蛋白质合成(如卡那霉素)、细胞壁生物合成(如青霉素)和DNA复制/修复(如环丙沙星)来抑制细菌生长。而且，大肠杆菌素可能对人类没有毒性，因为它们的细胞毒性只对产生受体蛋白如BtuB、Cir、FhuA和OmpF的细菌有效，而这些受体蛋白不存在于人类细胞中。由于其的细胞杀伤活性，被认为是传统抗生素的可行替代品。此外，大肠杆菌素存在多个结构域，通过将它们和其他细菌素结合，为设计新型的绞痛蛋白提供了灵活性。

因此，大肠杆菌素的进一步工程可能提供具有新功能和结构特性的新蛋白质，可用于控制细菌感染。有研究证明大肠杆菌素或许有能力杀死被称为持久存留细胞的非生长细胞，这些细胞可以通过进入代谢休眠状态在抗生素治疗下存活。然而，大肠杆菌素的重组生产需要共同生产免疫蛋白来保护宿主细胞;否则，大肠杆菌素对宿主细胞是致命的。

传统的基于细胞的合成方法受限于细胞生长、维护、污染等因素，特别是一些难表达的毒性蛋白。为了突破这些限制以及为高效蛋白质制备和研究提供更多选择，无细胞蛋白表达技术应运而生。与活细胞系统相比，CFPS是一个更灵活、可控的实验平台，为研究人员提供了以下优势：

1.开放的反应环境为新合成的蛋白质带来了以前没有的控制水平和设计自由度;

2.通过使用PCR产生的线性DNA模板，无细胞系统可以省去耗时的克隆步骤;

3.无细胞系统可以在没有细胞的情况下产生有毒蛋白质。

今天小编和大家分享一篇发表在Synthetic Biology期刊上的文章“Rapid production and characterization of antimicrobialcolicins usingEscherichia coli-based cell-free protein synthesis(基于大肠杆菌的无细胞蛋白质合成法快速生产抗菌大肠杆菌素及其特性研究)"，旨在为大家介绍一种可以用于快速表达毒性蛋白的方法。

研究背景

无细胞蛋白质合成(CFPS)是一个很有前途的灵活表达和筛选酶的平台。CFPS已被用于构建抗微生物肽库，表征肠道菌素L50A和L50B，并鉴定Col E1质粒DNA产生的大肠杆菌素E1。CFPS还用于产生毒性蛋白质，如癌症治疗癌酶。

在这项研究中，作者使用基于大肠杆菌的CFPS系统，用于大肠杆菌素的快速合成和表征。研究报道，大肠杆菌素E1和E2能有效地清除药物持久存留细胞。进一步证明了CFPS系统用于毒性蛋白质合成和表征的可行性，并为开发大肠杆菌素作为下一代抗菌药物提供了新的平台。

结果

1.“无细胞"提取物的制备

细胞裂解物使用超声处理法从大肠杆菌BL21(DE3) Star菌株的培养物中制备。通过注射器过滤的方法从提取物中去除在离体制备过程中通过离心未分离的活细胞。并使用这种过滤方法得到的“无细胞"提取物来合成大肠杆菌素。

2.CFPS合成大肠杆菌素

研究人员合成了具有不同功能的不同类型大肠杆菌素，包括肽聚糖生物合成抑制的大肠杆菌素M、成孔的肠绞痛素Ia和E1以及核酸酶大肠杆菌素E2 。CFPS不受细胞活力限制，使研究人员能够在没有免疫蛋白的情况下产生高滴度的大肠杆菌素，使用CFPS的可溶性大肠杆菌素的产量是体内大肠杆菌素产量的10倍，通常约为24-28μg/ml。与耗时的克隆相比，研究选择使用大肠杆菌素基因的线性DNA模板来更快地生产大肠杆菌素。通过增加PCR模板的量(与200 ng pCC1-cia质粒相比，200 ng Ia基因PCR产物)将Ia产量提高到与质粒模板Ia生产几乎相似的水平。

图1：无细胞大肠杆菌素合成

3.大肠杆菌素核酸酶E2通过不含免疫蛋白的CFPS合成

为了避免宿主细胞毒性，大肠杆菌素必须通过同源免疫蛋白与细胞毒性结构域的结合来阻断。例如，大肠杆菌素E2作为DNA酶发挥作用，E2免疫蛋白在体内同一操纵子中共同产生。在没有E2免疫蛋白的情况下，研究人员使用CFPS产生了260±10μg/ml的E2(图1A)。结果表明，在不存在免疫蛋白的情况下，可以使用CFPS生产核酸酶E2大肠杆菌素，而不考虑合成的大肠杆菌素E2对DNA模板的降解。

图2：E2免疫蛋白对DNA降解和无细胞E2产生的影响

4.无细胞合成的大肠杆菌素在细胞杀伤中具有活性

作者研究了未经纯化的无细胞合成的大肠杆菌素的细胞杀伤活性。首先，使用不同浓度的大肠杆菌素E1进行细胞活力测试，以确定其适合浓度。暴露于250 ng/ml或更高浓度的大肠杆菌素E1后，我们没有检测到任何存活细胞(图3A)。先前有报道称，大肠杆菌素在1分钟内迅速使99%以上的靶细胞失活。该研究观察到无细胞合成的E1(750 ng/ml)仅暴露1分钟就灭活了99.9%以上的细胞(图3B)，证实了之前的研究，并且用E1处理的细胞培养物没有显示生长。而未经大肠杆菌素的培养物的细胞群(图3B)和浊度(图3C)增加。除了大肠杆菌素E1活性外，我们还观察到在LB培养基中暴露于大肠杆菌素Ia和E2的样品中的大量细胞死亡(图3D)。这些结果表明，未经纯化的无细胞合成大肠杆菌素是具有活性的，并在富培养基中快速灭活细胞。

图3：无细胞合成绞痛蛋白的活性(将K361细胞暴露于无细胞合成的大肠杆菌素，未添加大肠杆菌素质粒作为对照组(No.Col)

5.大肠杆菌素在营养丰富和无营养条件下的活性比较

由于大肠杆菌素细胞杀伤机制会物理损伤靶细胞的内膜或切割核酸，研究评估了大肠杆菌素在非生长、无营养条件下对细胞的活性，以确定大肠杆菌素是否能提供优于抗生素的优势，其中大多数抗生素只能杀死生长中的细胞。研究结果证实，大肠杆菌素的细胞毒性取决于靶细胞的代谢状态，很可能是因为摄取需要能量。不同类型的肠绞痛蛋白的细胞杀伤活性可能不同，如果营养供应不能充分激发靶细胞，则可能降低细胞杀伤活性(图3D、3E)。

6.不同浓度大肠杆菌素的细胞毒性比较

为了比较无细胞合成的绞痛蛋白之间的细胞毒性，我们评估了不同浓度大肠杆菌素处理后的细胞活力。细胞毒性实验结果证实，在本研究其他地方使用的大肠杆菌素浓度(750 ng/ml)在很大细胞毒性范围内，大肠杆菌素E1和E2具有高细胞毒性，但Ia没有。此外，研究还证实了无细胞合成的大肠杆菌素E1的细胞毒性与体内产生的大肠杆菌素相当(图4A、4B)。

图4：不同浓度大肠杆菌素的细胞杀伤活性

7.大肠杆菌素E1和E2杀死持久存留细胞

由于肠绞痛蛋白E1和E2在0.85%NaCl和LB中杀死细胞(图3D和E)，我们推断这些肠绞痛蛋白可能有效杀死持久细胞，持久存留细胞是在应激条件下形成的休眠、非代谢细胞群。由于持久存留细胞不生长，即使没有获得耐药性机制，它们对高浓度的抗生素也不敏感。研究结果表明大肠杆菌素可以以不同的持续状态穿透靶细胞，并物理损伤内膜(通过E1)或降解DNA(通过E2)，这是抗生素无法实现的。大肠杆菌素的细胞杀伤活性可能使我们开发出控制不生长的持久存留细胞的新策略(图5)。

图5：大肠杆菌素除去持久存留细胞

总结

研究发现使用CFPS可以产生抗菌大肠杆菌素，并且无细胞合成的大肠杆菌素可以在不纯化的情况下有效杀死靶细胞。CFPS能够从线性DNA模板快速生产和表征大肠杆菌素，而不需要共同生产免疫蛋白。研究还发现大肠杆菌素E1和E2在无营养条件下表现出细胞杀伤作用，并除掉持久存留细胞。为利用大肠杆菌素作为强大的新工具来解决日益严重的抗菌耐药性问题提供了机会。此外，本研究进一步证明了CFPS在生产有毒蛋白质方面的优势，并扩展了CFPS平台在高通量蛋白质合成和表征中的应用。