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你有没有想过一个问题：明明有64种密码子，但却只编码20种氨基酸（密码子的冗余性）。如果我们把冗余密码子腾出，重新分配给非标准氨基酸，那么是不是就可以构建"非天然遗传密码"，进而编码新化学反应、新型治疗分子以及生态系统工程。
然而，传统基因组编辑路径需要进行大规模、多轮次的改造，周期长、成本高。
今天小编和大家分享一篇发表在 Nature 上的突破性成果——Automated prototyping of genetic codes，该研究团队开发了 AGENTEX（Automated genetic tRNA Expansion）平台，将遗传密码的原型设计转变为机器人自动化、多重并行、数据驱动的无细胞流程。
一、研究背景及问题
合成生物学对遗传密码的改造已有大量积累：超过 400 种非天然氨基酸已被引入活细胞蛋白，重编码菌株也展现出增强病毒抗性、降低水平基因转移等特性。但目前仍面临根本性瓶颈：
在完整基因组中重新分配多个有义密码子，需大量基因组编辑操作，历时长，难以迭代，而且在活细胞内重分配多个有义密码子，还会与宿主内源 tRNA 发生难以预测的串扰；
在一条多肽中同时掺入多个非标准单体并保证高纯度，现有技术手段不足；
需要翻译系统更重新设计，才能实现从序列空间到序列定义化学的控制。
基于这些问题，该研究团队主张与其在完整基因组尺度上"试错"，不如先在体外快速、系统地验证遗传密码的设计空间。即在无细胞体系中实现快速、高通量的遗传密码原型设计，绕开基因组编辑。
图1：AGENTEX支持遗传密码的多重检测及基于测序定义的生物聚合物合成
二、方法创新：tSCAN 与 tSCAN-M，高通量"读"出氨酰化
翻译机器对 tRNA 3' 末端保守序列 CCA 高度依赖：核糖体大亚基通过碱基配对识别 CCA 端，确保只有正确氨酰化的 tRNA 才能进入翻译。研究人员将大肠杆菌 23S rRNA 的 G2251 和 G2553 突变为 G2251C 和 G2553C，使其只接受 3' 末端为 CGA 的合成 tRNA（otRNA）；天然 aaRS 则继续在裂解液中为这些 otRNA 氨酰化。
如此，正统翻译系统照常运转，合成系统严格听命于设计好的密码子。实现这一路径就需要一种能够并行量化复杂 tRNA 池中每个物种氨酰化水平的方法。
tSCAN：基于自动化 NGS 的 tRNA 充电测序，氨酰化的 tRNA 受高碘酸盐氧化保护、保留末端腺苷，未氨酰化的 tRNA 则失去末端腺苷，测序统计完整/截短读段比例即可定量池内每个 tRNA 的氨酰化水平。
tSCAN-M：以同位素标记 ATP 结合 LC-MS，直接读出 tRNA 上装载的氨基酸身份。
此外，整个流程部署在开源的 Opentrons OT-2 机器人平台上，实现了芯片合成寡核苷酸池→dsDNA→体外转录 tRNA→无细胞反应→测序的全自动化。一个实验周期即可并行测试数十套 tRNA 池与密码子组合——遗传密码设计从"逐个猜测"变为"成批扫描"。
图 2：使用 tSCAN 技术进行氨基酸亚氨基化反应的自动识别
三、研究结果
借助这套自动化无细胞工作流，研究团队得到以下结果：
1.裂解液环境是 otRNA 氨酰化的关键：在完整酶系的裂解液中，几乎所有大肠杆菌 aaRS 都能为大多数非 CCA 末端 tRNA 氨酰化，其中 CGA 末端表现最佳，CCA 序列对突变的容忍度远超以往认知；
图3：通过 tSCAN 在 PURExpress 系统中（a,b），或E.coli系统中（c,d）收集到的氨基化数据
2.同样的 tRNA 转入缺乏修饰酶的 PURE 体系后，CGA、CUA、CAA 末端 otRNA 的充电率骤降，直观证明天然 tRNA 修饰；
3.核糖体能够防止翻译过程中的干扰现象：Ser/Ala 反密码子互换的 tRNA 池加入野生型核糖体体系后，质谱检测不到误掺入。
图4：核糖体以及 tRNA 的 3'端能够防止不同遗传密码之间的相互干扰
在此基础上，AGENTEX 成功并行测试标准密码子、MP1、MP2 三个体系，实现最多 3 个密码子重分配，成功掺入非天然氨基酸，翻译产物经 Orbitrap、ZenoTOF 质谱严格验证。此外，这套系统自带天然生物遏制：otRNA + 改装核糖体，一旦进入活体细胞，谁都不认谁——一进大自然就“死机"。
图5：利用 otRNA 和突变型核糖体进行序列解码，从而将多肽翻译成具有扩展遗传密码的序列
四、结果与展望
传统模型认为 tRNA 的 CCA 端同时被 aaRS 与核糖体识别，遗传密码由基因组线性指定。本文提出存在“aaRS–tRNA 相互作用"与“tRNA–核糖体相互作用"的平衡约束；若 tRNA 3′ 端与核糖体大亚基协同突变（如 CGA 端与 G2251C/G2553C 配对），即可衍生出替代遗传密码。这一框架为理解遗传密码的过去形态与未来扩展提供了理论工具。
在产业前景上，该方法为合成含多个非标准单体的序列定义生物聚合物——包括新型材料、修饰化药物蛋白与人工酶——提供了通用平台。以 AGENTEX 为代表的"无细胞先行"工作流，将推动遗传密码与翻译机器的探索进入快速迭代、数据驱动的新阶段，也让无细胞蛋白表达技术从"表达工具"升级为"设计平台"。
五、无细胞蛋白表达能解决什么问题？
对很多课题组和企业来说，蛋白表达至今仍是“玄学"：换载体、换宿主、调温度、试诱导条件，一搞就是几个月，最后可能还是一锅包涵体。
无细胞蛋白表达（CFPS）提供的是一套不同的打法：
极速交付：从 DNA 模板到拿到蛋白，最快 48 小时；这篇 Nature 里整条流水线都是机器人自动跑的，人只负责“设计"；
免克隆：线性 PCR 产物直接翻译，省掉载体构建与转化；
高通量并行：96 孔板一次筛几十上百个变体/条件；论文里 tSCAN 一次测几百条 tRNA，就是同类思路；
“难搞"蛋白友好：膜蛋白、毒性蛋白、易降解蛋白都能表达；
可编程修饰：非天然氨基酸掺入、正交翻译系统、密码子重编码，为下一代生物制造开绿灯；
适合谁用？
被膜蛋白、毒性蛋白卡住进度的课题组；
需要快速验证几十个突变体 / 酶变体的企业；
想做非天然氨基酸、遗传密码扩展等前沿方向的团队；
写在最后
这篇 Nature 的意义，不只是“又一项合成生物学突破"。它预示着一个趋势：蛋白质合成正在从“生物实验室"走向“可编程的制造平台"，而无细胞表达就是那个平台的基建。
如果您也有“表达不出来的蛋白"，或者想试试更快的表达方式，欢迎联系苏州珀罗汀生物——无细胞蛋白表达整体解决方案。
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