精准筛选，快速验证：CFPS革新蛋白质设计

更新时间：2025-01-03 点击次数：78

蛋白质是生命体的基本组成部分，参与了几乎所有的生命活动，是生命活动的主要承担者。蛋白质研究对于理解生命本质、疾病诊断和治疗、新药开发等都具有重要意义。而蛋白质设计在蛋白质研究中扮演着至关重要的角色，它不仅突破了自然进化的限制，允许研究人员创造出具有全新或功能优化的蛋白质，还加速了新药研发进程，推动工业酶的优化，并为合成生物学的发展提供了有力支持。

今天小编和大家分享一项今年9月份发表在《Protein Science》上的研究，作者介绍了CFPS在蛋白质设计中的应用，并探讨了其优势、挑战及未来发展方向。

一、研究背景

蛋白质设计的目标是创建具有特定功能的蛋白质，目前，基于物理的方法虽然能够提供详细的结构信息，但成功率相对较低。相比之下，基于机器学习的方法显著提高了设计的成功率，但设计失败的情况仍然普遍。而且，无论采用哪种方法，最终都需要通过实验来验证设计的蛋白质是否具有预期的功能。当前主要的挑战是从数十到数百个设计中筛选出那些具有预期功能的蛋白质，并且要明确设计失败的原因，包括表达和可溶性问题以及未能形成正确的结构和功能的原因。因此，寻找一种高效、便捷的方法来筛选和验证蛋白质设计显得尤为重要。

二、无细胞蛋白合成在蛋白质设计中的应用

无细胞蛋白合成（CFPS）提供了一种更为简单的方法来识别功能性设计，并能解释设计为何未能如预期般表现。CFPS相比在传统生产重组蛋白的方法具有多个优势，如不受宿主细胞存活限制、可生产细胞毒性蛋白、反应仅由目标DNA编程、条件易于调整、适合小体积筛选且成本低。此外，CFPS更便于生产制造和测试设计蛋白的功能，并探索设计失败的原因，从而可以提供丰富的数据集以优化后续设计等。

图1:表示功能性蛋白质设计的识别的示意图

三、活性筛选

在蛋白质设计中，筛选活性是关键步骤之一。CFPS作为一种高效且灵活的方法，在这一过程中发挥了重要作用，它可以快速评估蛋白质的活性，同时还能帮助识别设计失败的原因。此外，CFPS可以在微孔板或微流控设备中进行，反应体积小，适合大规模筛选。例如，通过荧光或比色法可以直接检测酶活性，而无需复杂的纯化步骤。CFPS还可以用于高通量筛选，例如Rapp等人通过机器人自动化系统结合CFPS来探索蛋白质的热稳定性和活性。这种方法不仅提高了筛选效率，还能够在短时间内排除无效的设计。从而快速筛选出功能性蛋白质，还能为设计失败提供宝贵的信息，从而指导后续的设计改进，例如，de los Santos等人通过CFPS筛选出具有特定DNA结合活性的转录抑制因子突变体，Rolf等人通过优化反应条件提高酶的可溶性产量。总之，CFPS是一种简单、信息丰富且易于操作的技术，非常适合用于蛋白质设计和验证流程。

图2:使用CFPS评估蛋白质功能的案例

四、表面捕获的CFPS产生的蛋白质

蛋白质表面捕获是评估蛋白质功能的重要手段。通过将蛋白质产品固定到固体表面上，可以将其与CFPS试剂分离，从而通过清洗表面实现这一目的。这使得可以在不同条件下测试蛋白质活性，如pH值、温度、缓冲液成分以及对不同底物的反应性。并且可以测试每个突变体在多种条件下的表现。如，PISA（Protein In Situ Array）技术通过镍涂层表面捕获带有His标签的蛋白质，实现高通量功能检测。最近，Thornton将自组装蛋白质表面用于共价捕获无细胞合成的蛋白质。具体来说，可通过His标签蛋白、生物素化的DNA、BslA-SpyTag 形成自组装蛋白质单层等策略来实现表面补获。这些方法不仅能够高效地捕获蛋白质，还能够在不同的实验条件下进行蛋白质功能的测试，从而为蛋白质设计和功能研究提供了强大的工具。

图3:CFPS的表面捕获策略示例

五、CFPS用于识别设计失败的原因

当前蛋白质设计可能因多种原因而“失败"，不仅仅是未能实现预期的结构和功能。而CFPS能够帮助识别导致设计失败的原因，包括转录、翻译、聚集和错误折叠等问题。例如通过添加染料结合适配体序列测试转录，通过融合荧光蛋白或四半胱氨酸迷你螺旋标签测试翻译，通过荧光赖氨酸残基或放射性氨基酸测试溶解度，通过高通量蛋白酶切试验评估蛋白质折叠。

通过这些方法收集的实验数据可以帮助区分设计失败的不同原因，从而利用数据驱动的方法识别可能导致失败的设计蛋白质的特性，并将这些结果纳入未来的蛋白质设计算法中。这不仅有助于提高设计成功率，还能为蛋白质设计领域提供宝贵的反馈信息。

图4:CFPS来识别蛋白质设计可能的失败点

六、结论

CFPS作为一种快速、灵活且多功能的技术，相对于传统表达方法的优势显著，适合用作多种蛋白质设计项目的中介筛选工具，无细胞系统能够实施各种功能检测，这使得研究人员可以轻松评估不同设计的功能（而不仅仅是结构）。通过结合计算设计（机器学习等）和高通量筛选，CFPS不仅提高了蛋白质设计的成功率，还加速了新功能蛋白的发现和应用。在中等通量水平下，CFPS为研究人员提供了一种可行的技术，可以并行测试多种蛋白质设计的功能。因此，可以预见CFPS将在未来成为促进蛋白质设计的更加重要的工具。

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