无细胞蛋白表达技术是一种先进的体外重组蛋白质表达技术，是利用含有蛋白质合成必需组分的细胞裂解物，在体外条件下进行蛋白质合成的过程。这些必需组分通常包括核糖体、转运RNA（tRNA）、氨酰合成酶、启动/延伸/终止因子、三磷酸鸟苷（GTP）、ATP、Mg2+和K+等。该技术通过在体外模拟细胞内的蛋白质合成环境，实现了不依赖于完整细胞体系的蛋白质生产。
无细胞蛋白表达技术是一种在体外模拟蛋白质合成过程的技术，不依赖完整的细胞结构。以下是使用该技术时需要注意的一些关键事项：
一、模板DNA方面
纯度要求
模板DNA的纯度对无细胞蛋白表达至关重要。如果模板DNA含有杂质，如蛋白质、RNA、有机溶剂等，可能会干扰无细胞翻译系统的反应过程。例如，残留的蛋白质可能会与无细胞系统中的酶竞争底物，或者影响酶的活性。一般要求模板DNA的纯度达到较高的标准，A260/A280比值通常在1.8-2.0之间，以确保模板DNA的质量。
需要通过合适的纯化方法，如酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等，去除杂质，以获得高质量的模板DNA用于后续的无细胞表达。
浓度优化
模板DNA的浓度需要合理调整。浓度过低可能导致蛋白质产量低，因为参与翻译的模板数量有限；而浓度过高则可能会引起模板之间的相互干扰，或者使反应体系的黏度增加，影响物质的扩散和反应效率。
不同的无细胞表达系统对模板DNA的优浓度要求不同，一般需要通过预实验来确定。例如，对于某些基于大肠杆菌裂解物的无细胞表达系统，模板DNA的浓度可能在50-200 ng/μL之间较为合适。
二、原料供应方面
氨基酸供应
确保无细胞系统中有足够且平衡的各种氨基酸是关键。缺乏任何一种必需氨基酸都会导致蛋白质合成不完整或产量降低。
有些特殊的氨基酸，如硒代半胱氨酸，在某些蛋白质的合成中是必需的，但在常规的氨基酸混合物中可能不存在，这时需要另外添加。同时，氨基酸的浓度也会影响蛋白质表达，过高的氨基酸浓度可能会抑制反应，因此需要根据具体的表达系统和蛋白质进行优化。
能量物质供应
无细胞蛋白表达需要能量物质来驱动反应，通常是三磷酸腺苷（ATP）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。ATP为蛋白质合成提供能量，包括肽键的形成、氨基酸的激活等过程都需要ATP参与。NADPH主要参与一些需要还原环境的步骤，如二硫键的形成等。
这些能量物质的浓度需要维持在合适的水平。如果ATP浓度过低，蛋白质合成会因为能量不足而受阻；如果浓度过高，可能会导致系统的渗透压改变，影响反应的正常进行。一般会根据无细胞系统的特性和反应规模来确定能量物质的添加量。
三、反应条件控制方面
温度控制
温度对无细胞蛋白表达中的酶活性有显著影响。不同的酶在无细胞系统中有其最适反应温度。一般来说，无细胞表达系统的反应温度在室温（20-25°C）到37°C之间。温度过低，酶的活性会降低，蛋白质合成速度变慢；温度过高则可能导致酶变性失活。
例如，对于一些来源于大肠杆菌的无细胞表达系统，37°C可能是比较合适的温度，但这个温度也可能会加速系统的蒸发和成分的降解，所以需要在反应过程中通过合适的设备（如恒温水浴、金属加热块等）精确控制温度。
pH值控制
pH值会影响蛋白质的电荷状态和酶的活性。无细胞蛋白表达系统通常有一个最适pH范围，一般在7.0-8.5之间。不适当的pH值可能会导致氨基酸的离子化状态改变，影响翻译过程中的氨基酸活化和肽链延伸。
同时，pH值的变化还会影响无细胞系统中各种酶的活性，例如，负责蛋白质折叠的分子伴侣在不适当的pH条件下可能无法正常发挥功能。可以通过添加缓冲液（如Tris-HCl、HEPES等）来维持反应体系的pH稳定。
离子强度控制
离子强度对无细胞蛋白表达也有重要影响。合适的离子强度可以维持蛋白质和核酸的结构稳定性，促进酶与底物的结合。
过高的离子强度可能会屏蔽分子间的电荷相互作用，干扰反应；过低的离子强度则可能导致蛋白质和核酸的聚集或沉淀。通常通过添加适量的盐（如氯h钾、氯化钠等）来调节离子强度，使其适应无细胞表达系统的要求。
四、抑制因素方面
内源核酸酶抑制
无细胞系统中可能存在内源核酸酶，这些核酸酶会降解模板DNA和mRNA，从而降低蛋白质表达的效率。为了防止这种情况，需要添加核酸酶抑制剂，如RNasin（用于抑制RNA酶）和某种DNA酶抑制剂。
不同的无细胞系统可能需要不同类型和浓度的核酸酶抑制剂。例如，在一些植物无细胞表达系统中，由于植物组织本身含有较多的RNA酶，可能需要添加较高浓度的RNasin来有效抑制RNA降解。
蛋白酶抑制
无细胞系统中也可能含有蛋白酶，这些蛋白酶会降解新合成的蛋白质。添加蛋白酶抑制剂（如苯j基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）等）可以保护目标蛋白质不被降解。
但是，蛋白酶抑制剂的使用需要谨慎，因为某些抑制剂可能会对无细胞系统中的酶产生非特异性抑制。在选择蛋白酶抑制剂时，需要考虑其特异性和对无细胞系统的兼容性。
