“避坑” 必看！无细胞蛋白表达常见问题解答

无细胞蛋白表达（Cell-free protein synthesis）是指将细胞内合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖体及转录翻译辅助因子等分子机器提取出来，并辅以核苷酸、氨基酸、能量物质及基因模板，在没有活细胞参与的体外直接合成蛋白质的生物合成反应。无细胞蛋白表达的技术原理是中心法则，是转录和翻译的体外进行。即在无细胞结构的反应体系中，目的蛋白的DNA 模板在RNA聚合酶的作用下转录出mRNA ，随后在氨酰-tRNA合成酶、核糖体以及tRNA的作用下，以mRNA为模板翻译出目的蛋白。

一是反应周期短，无细胞蛋白表达省去了传统细胞表达转染、培养等步骤，可以在几小时到一天内表达蛋白。以苏州珀罗汀（PLD technology）的无细胞试剂盒为例，最快可以1小时产出蛋白，适合进行蛋白快速交付。

二是可以与自动化设备结合，在多孔板（如96孔板），进行自动化高通量蛋白表达，短时间内高通量蛋白筛选的需求，适合酶定向进化筛选、AI蛋白制造等领域。

三是可表达蛋白种类多。有些蛋白在传统的细胞表达系统产量低甚至不能表达，而无细胞系统可以摆脱细胞自身生理功能限制，广泛适用于细胞因子、抗体、膜蛋白、毒性蛋白、包涵体蛋白表达等场景。

四是自由度与可控程度高，可以引入非天然氨基酸，实现特定位置修饰，适合ADC药物开发领域。此外，无细胞蛋白表达相较于传统细胞表达流程更短、操作更简便。

无细胞蛋白表达能解决传统蛋白表达流程长、耗时久、膜蛋白与毒蛋白等难表达的痛点与难点。无细胞体系可以表达膜蛋白，目前国内的珀罗汀生物有适合膜蛋白的无细胞蛋白表达试剂盒，只要按照说明书将膜蛋白的DNA模板，合适的表面活性剂或纳米盘等，加到表达试剂中，几小时到一天就能得到膜蛋白。

珀罗汀无细胞表达系统可以通过控制反应温度、添加分子伴侣、辅助因子等，帮助形成正确的蛋白折叠，合成的蛋白具有与细胞表达系统相当甚至更好的活性。与常规的细胞表达一样，无细胞系统表达产物除目标蛋白之外还有其他蛋白残留。对于抗体亲和性和酶活性的检测，无细胞表达产物可以无需纯化直接测试；对于有蛋白纯度要求或需要进行细胞实验的项目，按照相应蛋白常规表达后的纯化流程操作即可。

无细胞技术可以表达二硫键蛋白，但具体视厂商的产品而异。珀罗汀生物推出的无细胞蛋白表达产品均支持表达二硫键蛋白。原核生物来源的无细胞体系无糖基化修饰，真核生物来源的无细胞体系具有有限的糖基化修饰。

 Q6：无细胞体系的效能如何？可以放大到什么规模？

无细胞体系的效能一般与目标蛋白有关，表达量从μg/mL到数百μg/mL不等。以珀罗汀生物无细胞蛋白表达试剂盒为例，蛋白表达量最高可以达到3 mg/mL。无细胞体系可以放大，已有进行百升级规模化生产的报道。

线性模板、质粒模板都可以。但是线性模板要在目的基因两端各引入一段特定序列，以在目的基因两侧引入转录和翻译所需的因子。PLD无细胞蛋白表达试剂盒会提供质粒载体，将目的基因重组到质粒载体上，表达效果往往优于线性模板。无细胞试剂盒一般对DNA模板在反应体系中的浓度有要求，要根据具体要求与反应规模确定模板的用量。