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在抗体药物和疫苗研发的赛道上，时间就是生命。然而，从一只免疫过的动物体内，高效、精准地找到那个能紧密结合目标抗原的抗体，却是一个经典难题。传统的抗体发现流程往往像大海捞针，需要经历漫长的文库构建和多轮筛选。
图1：用于抗体筛选的噬菌体展示及平移工作流程[1]
今天小编和大家分享一篇发表于《Preparative biochemistry & biotechnology》的研究“Direct rescue and rapid confirmation of antigen-binding of dominant VH and VL of chickens"。该研究为解决这个难题提供了一个巧妙的新思路，研究人员通过构建一个高效的工作流程——“频率到功能"（frequency-to-function），直接将高通量测序得到的“大数据"即免疫后出现频率最高的抗体基因序列，快速转化为有功能的抗体分子，并进行验证。
一、研究背景：从“序列"到“功能"的漫长跋涉
在面对复杂多变的病原体时，免疫系统能够产生多样化的抗体来应对。这些抗体中，某些序列因其高频出现而被认为是免疫优势克隆，它们可能与特定抗原具有高亲和力结合。
但是，如何找到它们？
目前的主流方法是噬菌体展示技术，虽然有效，但需要经过“吸附–洗脱–扩增–重复"的多轮生物筛选（Panning），一般要花费16周的时间，且步骤繁琐。近年来，随着二代测序技术的发展，我们能够对免疫后的抗体基因库（即抗体谱）进行深度测序，精确地知道哪些抗体序列是免疫反应中的“优势克隆"。
然而，如何快速验证这些高频序列是否真的能结合抗原？
二、破局：无细胞表达系统的“降维打击"
为了解决传统方法的痛点，该研究团队设计了一套全新的“频率到功能"的工作流程，实现了从序列信息到功能验证的快速直达，大幅降低时间成本。
核心策略：结合深度测序技术和无细胞表达系统（CFES），直接将测序数据中高频重链（VH）和轻链（VL）序列“拎出来"，组合成单链抗体片段，然后利用CFES进行生产，并用ELISA试验检测其结合活性。通过这套“测序-合成-检测"组合拳，实现了从序列信息到功能验证的快速直达。
流程对比：
研究意义
该研究为抗体发现提供了一套通用、低成本、易落地的抗体筛选新范式。无需构建文库，直接对候选序列进行功能测试，大大缩短了研发周期。此外，该研究架起了“序列频率"与“功能验证"之间的桥梁，不仅验证了从鸡体内发现的优势抗体，还为理解沙门氏菌的免疫识别机制提供了新见解。更重要的是，该工作流程可广泛应用于各种物种的抗体开发，特别是在传统抗体发现技术受限的非模式生物中。
三、核心实验设计
1. 免疫与测序
研究人员用两种鸡伤寒沙门氏菌（S. Gallinarum）光滑型（SG002）和粗糙型（SR2-N6）分别对鸡做免疫处理。随后收集血清样本进行ELISA分析，分离出脾淋巴细胞，对其抗体VH和VL区域进行深度测序。数据分析锁定了每个免疫组中出现频率最高的“优势"序列。
图2：从SG002和SR2-N6免疫鸡中鉴定优势VH与VL序列
2.CFES抗体生产
研究人员将上述找到的优势VH和VL序列进行密码子优化，构建成单链抗体片段（scFv）。利用E. coli提取的CFES系统表达这些scFv，并通过SDS-PAGE和Western blotting评估其表达量和分子量。
3.功能验证
研究人员对比了His标签和V5标签，发现V5标签能大程度降低非特异性背景信号。随后，使用商业化的Salmonella group D O-抗原ELISA试剂盒，验证表达出的scFv的抗原结合能力。同时，通过构建已知抗原结合特性的参考scFv（12CA5-scFvHA），优化并验证了CFES-ELISA系统的特异性。
图3：scFv-S与scFv-R的无细胞表达及抗原结合能力评估
四、总结：7周频率→功能，开启抗体筛选快时代
该研究以无细胞表达为桥梁，省去繁琐克隆与筛选；以V5 标签系统为保障，实现高特异结合检测；以鸡抗沙门氏菌为示范，证明该流程在禽类疫病领域的实战价值。打通了“抗体组库高频序列→功能性单链抗体"的最后一公里。
在全球对抗微生物耐药、推动绿色养殖、加速诊断试剂开发的大背景下，这种低成本、高效率、高通用性的技术，必将成为抗体早期筛选的标配工具，让更多 “隐藏" 的优势抗体被快速发现。
五、未来展望
多物种应用拓展：不同物种的抗体库具有独特的序列特征和抗原结合能力，通过CFES系统，我们可以快速探索这些多样性，发现更多具有潜在应用价值的抗体分子。
结构生物学与计算生物学结合：通过结合CFES系统、冷冻电镜、X射线晶体学以及分子动力学模拟等技术，可以揭示抗体与抗原相互作用的分子机制，为理性设计新型抗体提供理论依据。
个性化医疗与精准诊断：在个性化医疗和精准诊断领域，抗体发挥着至关重要的作用。通过CFES系统可以快速定制针对特定抗原的抗体分子，为个体化治疗和精准诊断提供有力支持。
随着CFES、单细胞测序、AI 结构预测与自动化平台的深度融合，我们可以更深入地理解抗体的结构-功能关系，设计出更具特异性和亲和力的新型抗体分子，为抗体发现领域开辟了一条新的道路。
参考文献
[1] Yang H. Phage Display Technology: Design, Library Construction, and Panning Strategies for Antibody Development. Biomol Ther (Seoul). 2026;34(2):325-344. doi:10.4062/biomolther.2025.158.
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