全国服务咨询热线：
17351412161
17351412161
引言：当蛋白设计进入“百、千、万"的时代，真正的瓶颈是什么？
过去很长一段时间，蛋白质研发的核心问题是“如何获得一个目标蛋白"。研究人员通常围绕一个明确的蛋白序列建立表达载体，经过宿主转化、细胞培养、诱导表达、裂解、纯化，再通过酶活、结合、稳定性或结构分析判断蛋白是否符合预期。
这套流程经过多年发展已经相当成熟，但随着蛋白质工程、抗体发现和人工智能蛋白设计技术快速发展，研发范式正在发生一个非常明显的变化：研究人员面对的已经不再是一个或几个候选序列，而可能是几十、几百甚至上千个需要实验验证的蛋白设计。
随着AI辅助蛋白设计的发展，蛋白研发正在从少量候选物验证转向更大规模的序列探索，但计算设计最终仍然必须通过实验判断其真实的表达、稳定性和功能[1,2]。
2024年，Thornton等在 Protein Science 发表综述指出，CFPS特别适合对几十至数百个设计蛋白进行并行表达和功能筛选，并且能够帮助研究人员区分转录、翻译、溶解性以及最终结构与功能等不同层面的失败原因[1]。
这也意味着，蛋白研发的核心问题正在从“如何表达蛋白"逐渐转向“如何以更低成本、更短周期获得大量可靠的蛋白功能数据"。从这个角度来看，无细胞蛋白表达的意义并不只是提供一种新的蛋白制备方式，更重要的是，它有机会成为连接蛋白序列设计与功能数据之间的一座高速桥梁。
一、为什么传统细胞表达体系很难成为高通量筛选的最佳答案？
要理解CFPS为什么适合高通量筛选，首先需要重新审视传统细胞表达模式所面临的问题。
在大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞中表达重组蛋白，本质上是把目标蛋白的生产过程放进一个复杂的生命系统里。研究人员还需要考虑细胞生长状态、培养条件、诱导时间、蛋白毒性以及宿主自身代谢活动对表达结果的影响。当候选蛋白数量从几个增加到几十甚至几百个时，这些步骤就会迅速形成明显的规模化瓶颈。
CFPS则提供了一种不同的思路。它将蛋白质合成所需要的转录和翻译机器从细胞中释放出来，在体外建立一个开放的蛋白合成环境。研究人员可以直接加入DNA模板，并根据目标蛋白的特点调节反应体系中的温度、辅因子、脂质环境以及其他组分，从而把原本受到细胞生命活动约束的蛋白表达过程，转变为一个更加容易控制和并行化的生化反应。
这也是CFPS特别适合高通量筛选的根本原因：它把蛋白表达从“细胞培养流程"转变成了“可编程的微量反应"。
二、酶定向进化：CFPS让“突变—表达—活性"成为一个连续过程
酶定向进化本质上是在巨大的序列空间中寻找具有更高活性、更好热稳定性、更强底物特异性或者更优环境耐受性的蛋白变体。传统方法需要经历突变文库构建、宿主转化、培养表达、样品制备和酶活检测等多个步骤，而CFPS可以将其中的表达环节压缩到微量体外反应中，使大量突变体能够在相对一致的条件下快速获得。
CFPS在酶工程中的价值已经得到系统总结，其微量、并行的蛋白合成特点使研究人员能够在较短时间内获得大量酶变体，并进一步结合活性检测开展生物催化剂筛选[4]。
更进一步，如果把CFPS与自动化液体处理以及荧光或吸光检测结合起来，就可以建立一个典型的“突变体—表达—底物反应—活性读出"工作流。对于研究人员而言，真正需要关注的不再是“如何把384个蛋白分别表达出来"，而是如何设计一个可靠的功能检测体系，让384个蛋白能够在同一实验逻辑下完成比较。
珀罗汀生物公开的应用案例中，就包括基于CFPS进行phi29 DNA聚合酶突变体表达和活性筛选，以及GFP定点饱和突变体的高通量筛选；其公开资料显示，相关平台已经用于96个突变体的并行表达和功能检测。
不同phi29 DNA聚合酶的突变体有不同的活性强度
从技术路线来看，这类案例具有很强的代表性，因为它说明CFPS并不是停留在“快速表达"的层面，而是已经能够嵌入蛋白工程真正关心的功能筛选环节。
三、膜蛋白：开放体系让传统“难表达"问题变成可筛选的问题
传统细胞表达体系中，膜蛋白往往受到疏水性、膜定位、蛋白聚集以及细胞毒性等因素影响，因此表达条件优化通常需要较长时间。CFPS由于没有完整活细胞的生长和膜转运过程，研究人员可以直接在反应体系中引入去垢剂、脂质体或者纳米盘等膜模拟环境，并通过并行实验比较不同条件下的表达和溶解状态。
这意味着一个原本需要反复试错的问题，可以被转化为一个“条件矩阵筛选"问题：不同膜蛋白可以与不同浓度的去垢剂、不同脂质环境以及不同反应条件进行组合，从而快速寻找更合适的表达条件。
这一思路已经得到较为直接的实验验证。Bruni等建立了高通量CFPS膜蛋白表达筛选流程，对61种真核膜蛋白分别在两种去垢剂、两种脂质体和两种纳米盘体系中进行表达测试，结果显示，其中35种膜蛋白能够在至少一种脂质模拟体系中获得可溶性表达产物，占全部测试对象的57%[3]。
对于这一方向，珀罗汀生物近年来也将膜蛋白作为CFPS平台的重要应用之一，其公开技术资料显示，公司已经建立CFPS结合去垢剂以及纳米盘的膜蛋白表达方案，并进一步探索全长膜蛋白在纳米盘环境中的表达与交付。
四、真正值得关注的下一步：AI设计与CFPS实验形成闭环
现在的蛋白设计已经越来越依赖结构预测、机器学习以及生成式模型。AI可以在巨大的序列空间中快速提出候选方案，但计算预测终究无法替代实验，因为蛋白最终是否真正折叠、是否表达、是否具有目标活性，仍然需要真实分子进行验证。
因此，未来更加理想的蛋白工程流程并不是“AI替代实验"，而是：
AI负责提出更值得实验的序列，CFPS负责快速验证这些序列，功能检测负责产生真实数据，而这些实验数据再反馈给AI模型。
这就是所谓的“Design-Build-Test-Learn"闭环。
2024年，Rapp等报道了SAMPLE（Self-driving Autonomous Machines for Protein Landscape Exploration）自主蛋白工程平台，该系统利用智能算法学习蛋白序列—功能关系，并通过自动化机器人完成基因合成、蛋白表达和生化活性检测，再将实验结果反馈给模型，用于下一轮蛋白设计[2]。这一研究展示了“计算设计—自动化实验—数据反馈"闭环在蛋白工程中的可行性，也为CFPS进一步融入自动化蛋白研发平台提供了重要参考。
从这一角度看，CFPS最重要的战略价值其实并不是取代大肠杆菌、酵母或者CHO等成熟表达系统，而是成为这些体系之前的一层高速筛选和验证基础设施。
未来可能出现的典型研发模式是：AI一次产生数千条候选序列，算法首先根据结构和序列特征筛掉大部分低概率候选，再选择几十到几百条序列进入CFPS自动化表达，通过BLI/SPR、酶活、稳定性或其他功能实验获得真实数据，最后将这些数据重新输入模型，进行下一轮设计。
当这个循环能够在几天甚至更短时间内重复多轮时，蛋白工程的研发效率将不再主要取决于“一个蛋白需要多久才能表达出来"，而取决于一个研发团队一天能够产生多少高质量的序列—功能数据对。
结语：高通量蛋白研发的下一站，是让“序列"更快变成“答案"
蛋白质工程正在进入一个新的阶段。AI让研究人员能够提出新的蛋白序列，自动化技术让实验流程能够并行处理越来越多的样本，而真正决定这些设计能否走向应用的，仍然是实验数据。
无细胞蛋白表达恰好位于这个转变的关键位置。
它没有必要取代传统细胞表达体系，也不意味着所有蛋白都应该通过CFPS完成最终制备；它更现实、也更有价值的角色，是在蛋白研发早期承担一个高速的“Build"和“Test"环节，让大量候选序列能够以更低的成本、更短的周期获得真实的表达和功能数据。对于抗体发现、酶定向进化、膜蛋白研究以及AI生成蛋白验证而言，这种能力正在变得越来越重要。
而当CFPS与自动化、高通量功能检测以及AI进一步融合之后，蛋白工程正在从传统的“设计一个、表达一个、验证一个"，逐步走向批量设计、批量表达、批量筛选和持续迭代。
这或许才是无细胞蛋白表达技术在高通量筛选领域真正值得关注的未来。
参考文献
[1] Thornton EL, et al. Applications of cell free protein synthesis in protein design. Protein Science. 2024;33(9):e5148.
[2] Rapp JT, Bremer BJ, Romero PA. Self-driving laboratories to autonomously navigate the protein fitness landscape. Nature Chemical Engineering. 2024;1:97–107.
[3] Bruni R, Laguerre A, Kaminska AM, McSweeney S, Hendrickson WA, Liu Q. High-throughput cell-free screening of eukaryotic membrane protein expression in lipidic mimetics. Protein Science. 2022;31(3):639–651. DOI: 10.1002/pro.4259.
[4] Application of Cell-Free Protein Synthesis for Faster Biocatalyst Development. Catalysts. 2019;9(2):190.
微信扫一扫
