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生物体内的蛋白质结构基础是由自然界中存在的20种氨基酸构建而成的，然而，随着现代科技的飞速发展，医疗、食品科学及材料工程等领域对蛋白质性能的需求日益多元化和复杂化，这些天然蛋白质已难以满足这些多样化的应用需求。而非天然氨基酸（uAAs）及其参与合成的蛋白质逐渐展现出性能与潜力，探索利用非天然氨基酸对蛋白质进行改造的技术，正逐步成为科研领域中的一个研究热点。
uAAs作为人工合成的氨基酸衍生物，其化学性质和生物活性为蛋白质工程提供了无限可能。利用终止密码子在蛋白质中插入uAAs，可以广泛拓展蛋白质的结构和功能,增加蛋白质的新兴应用。但在传统的基于细胞的蛋白翻译系统中,翻译终止因子会和非uAAs竞争终止密码子位点，造成翻译的提前终止以及uAAs的低效表达。而且这些竞争因子大部分都是维持细胞存活的必需蛋白,无法在细胞内直接去除。而无细胞蛋白表达技术（CFPS）则凭借其优势和无限潜力，不仅为uAAs的表达和应用开辟了一片广阔的天地，也为蛋白质工程、药物研发、基础科学研究等领域注入了新的活力。
图1：目前已知的非天然氨基酸生物体合成途径
1.应用前景
药物研发与应用：传统医药的开发主要通过筛选现有的化合物库,但很多蛋白质药物很难通过化学合成来获得,缺乏对蛋白质药物的设计和改造。uAAs有着特殊的化学基团,这些基团可以给蛋白类药物带来新的空间结构,显著拓展蛋白药物的设计空间。常规药物主要由天然氨基酸通过非共价相互作用发挥疗效,具有结合不够稳定、容易解离而导致药效不理想的局限性,相比之下共价蛋白药物有着更大的治疗潜力。
图2：PD-L1共价药物开发原理
蛋白质工程和生物医学研究：uAAs可以用来探索蛋白质的结构和功能关系，揭示蛋白质的作用机制，并为蛋白质药物的设计和优化提供重要依据。通过在蛋白质中引入uAAs，可以实现对其结构和功能的精确调控，从而创造出具有全新功能的蛋白质分子。
材料科学：uAAs还具有良好的物理和化学性质，可用于合成高分子材料。这些材料在工业生产和日常生活中具有广泛应用，如塑料、橡胶和纤维等。通过引入uAAs可以赋予这些材料新的性能特性，如增强耐热性、耐腐蚀性和耐候性等。
2.局限性
合成成本高：uAAs主要通过化学合成法生产。这种方法存在反应步骤复杂、生产成本高以及对映体选择性差等缺点，限制了uAAs的规模化生产。
技术困难：在蛋白质工程中引入uAAs需要解决一系列技术挑战，如遗传密码扩展、tRNA/氨酰-tRNA合成酶对的优化等。这些技术难题限制了uAAs在蛋白质工程中的广泛应用。
表达量低：传统的细胞内表达存在很多问题，比如细胞毒性、竞争关系等等都会造成uAAs的低效表达。
无细胞非天然蛋白质合成系统，作为细胞内合成途径的有效辅助工具，极大地拓宽了蛋白质结构与功能的边界，已在蛋白质科学的基础研究与工业生产中展现出其价值。该系统摒弃了对完整活细胞的依赖，转而利用细胞提取物作为起点，通过补充能量来源及多样化的辅助因子，有效跨越了细胞膜的界限，为系统设计与过程控制的精细化提供了未有的灵活性。
图 ：无细胞非天然蛋白质合成体系
此外，该系统能够整合功能性uAAs，不仅优化了蛋白质的既有特性，还创新性地赋予它们全新的结构与功能维度。目前，在无细胞非天然蛋白质合成领域内，uAAs的引入策略可大致划分为两大类别：一类是基于天然翻译机制的全面抑制策略，另一类则涵盖了正交翻译体系下的终止密码子抑制、移码抑制、有义密码子再分配以及利用非天然碱基对等方法，这些策略共同促进了非天然蛋白质合成的多样性和高效性。CFPS技术在uAAs应用中的主要优势包含以下几个：
1.高效性与精确性
CFPS系统能够在短时间内完成大量蛋白质的合成，且通过优化反应条件，可以实现对uAAs插入位置和数量的精确控制。这种高效性与精确性的结合，使得研究人员能够更加快速地获得高质量的蛋白质产物，加速科学研究的进程。
2.灵活性与可定制性
与传统的细胞系统相比，CFPS系统具有更高的灵活性和可定制性。研究人员可以根据需要调整反应体系中的成分和条件，来适应不同uAAs和蛋白质的需求。这种个性化的优化策略不仅提高了合成效率，还保证了产物的纯度和活性。
3.快速响应与可扩展性
CFPS技术可以快速响应科研需求，并且可扩展性强。通过调整反应规模和条件，可以灵活应对不同规模的生产需求，满足从实验室研究到工业生产的多样化需求。
4.成本低
由于CFPS反应环境的开放性和可访问性，Prashanta Shrestha等人通过使用替代能源，将uAAs纳入CFPS的成本降低了55%。此外，无细胞系统允许直接使用线性表达模板的PCR产品，减少了繁琐的质粒库制备步骤。因此无论是在时间上还是金钱上的成本都会显著降低。
图 ：体内表达、基于质粒的CFPS和基于LET的CFPS的劳动力投资比较
相比于传统基于细胞的蛋白表达系统，CFPS技术有着明显的优势。此外，随着生物科技的不断发展和进步，CFPS技术在uAAs应用上的前景将更加广阔。
表1：无细胞及细胞非天然蛋白质合成体系比较
珀罗汀生物依托自主研发的CFPS技术已成功表达多个定点插入非天然氨基酸的候选抗体分子！
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